| Abstract | Ciljevi: Izražaj 5-HT (serotoninskih) receptora (sr) je analiziran tijekom ranog razvoja čovjeka u kralježničkoj moždini i ganglijima 16 ljudskih plodova (starih 5-10 tjedana), te u 9-tjednom fetusu sa spinom bifidom. Materijali i metode: Histološki uzorci tkiva ljudskog embrija i fetusa pripadaju Arhivskoj zbirci ljudskih embrija, pohranjenoj u Zavodu za anatomiju, histologiju i embriologiju Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Splitu. Korištenje ljudskog materijala odobrila su Etička povjerenstva KBC Split i Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Splitu. Imunohistokemijskom metodom dokazani su receptori na serotonin- pozitivnim stanicama (sr1, sr2 i sr3s), stanicama u proliferaciji (primjenom biljega Ki-67), kao i apoptotskim stanicama (primjenom kaspaza-3 i TUNEL metoda). Dvostruka imunofluorescencija korištena je za ko-lokalizaciju sr biljega s biljegom proteinskog gena peptida (pgp) 9.5 specifičnog za neurone te s GFAP biljegom za glijalne stanice. Također su korišteni elektronska mikroskopija i statistička mjerenja, uključujući semi-kvantifikaciju i izražaj različitih proteina kvantificiranih kao površina ispod krivulje (AUC) histograma intenziteta florescencije. Rezultati: Nakon procesa primarne neurulacije (pn), u kranijalnoj kralježničkoj moždini postupno se diferenciraju karakteristične zone kao što su ventrikularna zona (vz), intermedijarna zona (iz) i rubna (marginalna) zona (mz), kao i krovna ploča (r) i ploča dna (f) u području središnje linije. Imunohistokemijskim metodama uočeni su umjereni izražaj sr1 i sr2 i blagi izražaj sr3 receptora u neuroblastima kralježničke moždine i spinalnim ganglijima tijekom najranijih faza razvoja. Tijekom daljnjeg razvoja, izražaj sr1 postupno se povećavao prvo u motornim neuronima, a zatim i u autonomnim i osjetnim neuronima, dok su se izražaji sr2 i sr3 snažno povećavali u ploči dna i krovnoj ploči. Koekspresija biljega sr/pgp 9.5 bila je svojstvena razvoju neurona, dok je ko-lokalizacija izražaja sr/GFAP biljega uočena u krovnoj ploči. U ganglijima se ekspresija sr3 povećala samo tijekom ograničenog razvojnog razdoblja, dok je intenzitet sr1 i sr2 izražaja rastao tijekom cijelog istraživanog razdoblja. Kod malformiranog fetusa s cervikalnom spinom bifidom, poremećaji dorzalnog dijela kralježničke moždine (krovne ploče) uočeni su u područja kralježničke moždine kaudalno od njezinog cervikalnog rascijepa, dok su se gangliji činili veći nego u normalnog fetusa. U kralježničkoj moždini i ganglijima malformiranog fetusa, morfološke abnormalnosti pratio je slabiji izražaj sr1 i sr2 te jači izražaj sr3 u odnosu na normalni fetus iste dobi. Abnormalna morfologija krovne ploče uključivala je višak apoptotskih i proliferirajućih stanica i povećani izražaj sr3. Elektronska mikroskopija spinalnih ganglija u 10. tjednu razvoja pokazala je postojanje dvaju morfoloških oblika neurona (svijetle i tamne stanice) te apoptotičkih stanica, kojima je bila svojstvena vakuolizacija organela i dezintegracija stanične membrane. Zaključci: Naši rezultati ukazuju na postojanje obrasca izražaja sr koji je specifičan za ljudsku vrstu, važnost sr1 u diferencijaciji neurona te sr2 i sr3 u kontroli morfogeneze krovne ploče tijekom normalnog i poremećenog razvoja. Također smo pokazali važnost proliferacije glija stanica poput astrocita i oligodendrocita, kao načina zatvaranja krovne ploče u području kralježničke moždine ispod cervikalnog rascjepa u malformiranog fetusa sa spinom bifidom. |
| Abstract (english) | Objectives: We analyzed the expression of 5-HT (serotonin) receptors (sr) during early human development in the spinal cord and ganglia of 16 human conceptuses (5-10-weeks old), and in the 9-week fetus with spina bifida. Materials and methods: Histological samples of human embryonic and fetal tissue belong to the Archive Collection of human embryos, stored in the Department of Anatomy, Histology and Embryology, School of Medicine University of Split. The use of human material was approved by the Ethical Committees of the University Hospital in Split and School of Medicine in Split. The immunohistochemical method was used to detect receptors of serotonin-positive cells (sr1, sr2 and sr3s), proliferating (Ki-67) cells, as well as apoptotic cells (caspase-3 and TUNEL method). Double immunofluorescence was used for co-localization of sr markers with protein gene peptide (pgp) 9.5 marker for neurons, and with GFAP, marker for glial cells. The electron microscopy and statistical measurements, including semi-quantification and expression of different proteins quantified as the area under the curve (AUC) of florescence intensity histograms were used as well. Results: Following the primary neurulation process (pn), the cranial spinal cord gradually developed characteristic layers such as ventricular zone (vz), intermediate zone (iz) and marginal zone (mz), as well as roof (r) and floor plate (f) areas in the midline. By using immunohistochemical method, we found moderate (sr1 and sr2) and mild (sr3) expression in the neuroblasts of the spinal cord and ganglia during earliest developmental stages. During further development, gradual increase in sr1 expression characterized the motoneurons, as well as autonomic and sensory neurons, while strong increase in sr2 and sr3 expression was observed in the floor and roof plates. While the developing neurons were characterized by co-expression of sr/pgp 9.5, sr/GFAP co-localization was observed in the roof plate. In the ganglia, sr3 expression increased during limited developmental period, while expression of sr1 and sr2 increased throughout the investigated period. In malformed fetus with cervical spina bifida, aberrations of dorsal part of the spinal cord (roof plate) characterized the areas of the spinal cord caudal to its cervical dysraphyc part, while ganglia appeared larger than in normal fetus. In the spinal cord and ganglia of malformed fetus, morphological abnormalities were accompanied by weaker sr1 and sr2, and stronger sr3 expression. In the roof plate of abnormal fetus, we found the excess of apoptotic and proliferating, cells as well as an increased sr3 expression. Electon microscopy of the 10th week spinal ganglia revealed existence of two morphological types of neurons (light and dark cells) and apoptotic cells, characterized by vacuolization of organelles and disintegration of cell membrane. Conclusions: Results of our study point to the human-species specific expression pattern of sr, importance of sr1 in neuronal differentiation, and sr2 and sr3 in the control of the roof plate morphogenesis, both during normal and disturbed embryonic development. We also suggest importance of astrocyte and oligodendrocytes proliferation as a mode of closing of the roof plate area under the cervical spina bifida in malformed fetus. |
